根据公开报道，迄今为止，美国、英国和以色列等国的F-35战斗机都已经参与实战，当然，这里的实战主要指的是对地攻击，使用精确制导武器轰炸地面目标。事实上，俄罗斯国防部也宣称其苏-57战斗机在正式投入量产之前，已经在叙利亚的半实战环境下经过了考验。
有一说一，这些第五代战斗机的实战，除了以色列空军的F-35I，着实没什么稀奇之处：被轰炸的目标根本没什么像样的防空能力，顶多就是拥有便携式防空导弹，雷达预警更是连提都别提。也就是以色列空军的F-35I，穿越获得驻叙俄军支持的叙利亚防空网，轰炸位于叙利亚东北部和伊拉克境内的伊朗目标，才算是有点难度，即便如此，凭借其隐身性能，也是在炸弹投下爆炸后，保卫伊朗基地的叙利亚防空系统才朝着夜空胡乱发射导弹，然后“疑似击伤以色列F-35I战斗机”（最近这两年已经不这么说了）。
当地时间3月7日，以色列空军宣布，其拥有的F-35I战斗机已经于去年3月获得击落纪录，被击落的是两架试图潜入以色列领空的伊朗无人机，当时这两架无人机正试图飞往加沙地带，这也是全球范围内F-35战斗机获得的首次击落纪录。以色列空军称，这次击落战绩获得了周边国家的配合，两架伊朗无人机全程都被以色列防空网跟踪，在进入以色列领空前就被击落。
根据以色列国防部发布的视频，被击落的是两架伊朗制造的飞翼式无人机，确切说是仿制美国RQ-170无人机的Shahed-197，但体积要小得多，采用螺旋桨动力，被用来在远距离向真主党武装运送小型武器。不过，从这两架无人机被以色列雷达全程监视，再被F-35I击落看，伊朗仿制的这款飞翼式无人机看起来并不隐身，至少是隐身性能不佳。
目前，还不清楚以色列国防军发布的视频是从F-35I战斗机的（EOTS）还是从飞行员的头盔上拍摄的，也不清楚F-35I战斗机使用了什么武器，AIM-120主动中距弹、AIM-9X近距弹还是机炮？
被击落的伊朗飞翼式无人机残骸
截至目前，以色列是中东地区唯一装备五代机的国家，美国是否要向阿联酋出售F-35A还没有最终确定，但即便是出售，阿联酋获得的F-35A也被认为做了性能限制，也就是通常所说的“阉割版”，美国国会和美国政府致力于保证以色列空军在中东地区的绝对技术优势。同时，以色列也是全球目前拥有最丰富F-35战斗机使用经验的国家，并在美国的准许下，能够对其拥有的F-35I战斗机进行一定改装，安装以色列研发的航电设备和武器，这也是以色列拥有的F-35A战斗机获得F-35I独特编号的主要原因。